ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ИЗ ХВОСТОВОГО СТЕБЛЯ СИНЕЖАБЕРНОГО СОЛНЕЧНИКА (BF-2)

Доронин Максим Игоревич, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник, ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г.Владимир.

Пичуева Алена Александровна, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник, ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир.

Павлов Дмитрий Константинович, кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник, ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир.

Аннотация

 Проводили поиск оптимальной температуры культивирования и ростовой среды для получения монослоя клеток BF-2 с высокими показателями пролиферативной активности и его длительного хранения без деструкции. Применение культуральной среды DMEM/F12 при 15°С позволило получить наибольший прирост клеток BF-2 и сохранить монослой без изменений в течение 18-20 суток. Чувствительность клеток BF-2 к вирусам инфекционного некроза гемопоэтической ткани, инфекционного некроза поджелудочной железы, вирусной геморрагической септицемии лососевых рыб сохранилась на высоком уровне.

Abstract

 Carried out search of optimum temperature of cultivation and the medium for receiving a cell line of BF-2 with high rates of proliferative activity and its long storage without destruction. Application of the medium DMEM/F12 at 15°C allowed to receive the greatest gain of cell BF-2 and to keep a monolayer without destruction within 18-20 days. Sensitivity of the cell of BF-2 to the infectious haemopoetic necrosis virus, the infectious pancreatic necrosis virus, the virus hemorrhagic septitsemiya of salmon was at the high level.

Ключевые слова: культура клеток из хвостового стебля синежаберного солнечника (BF-2); культуральная среда MEM BSS, DMEM/F12, лейбовица L-15, RPMI-1640; температурный режим культивирования; индекс пролиферации; конфлюэнтный монослой.

Keywords: cell line from a bluegill fry caudal trunk (BF-2); culture medium MEM BSS, DMEM/F12, Leibovitz L-15, RPMI-1640; temperature condition of cultivation; proliferation index; confluent monolayer.

Введение

В мировой практике на сегодняшний день известно около 450 клеточных линий рыб, которые нашли широкое применение при выделении вируса из патологического материала и для оценки активности специфичных антител в реакции нейтрализации [1].

По данным МЭБ (OIE) в последние десятилетия в разных странах мира фиксируют вспышки особо опасных вирусных болезней рыб, таких как инфекционный некроз гемопоэтической ткани (ИНГТ), инфекционный некроз поджелудочной железы (ИНПж), вирусная геморрагическая септицемия (ВГС) лососевых рыб, которые наносят значительный экономический ущерб рыбоводческим хозяйствам [2,3].

Для выделения вирусов ИНГТ, ИНПж и ВГС из патологического материала рыб, применяют перевиваемую культуру клеток из хвостового стебля синежаберного солнечника BF-2 [4]. Клеточная линия BF-2 морфологически представляет собой ровный, плотный монослой из клеток фибробластоподобной формы, с крупными ядрами округлой формы [5].

С экономической точки зрения, важно достигать высоких показателей индекса пролиферативной активности культуры клеток BF-2  без снижения их чувствительности к вирусам объектов аквакультуры. Успешное культивирование постоянной клеточной линии BF-2 возможно при оптимальном составе ростовой среды и определенном температурном режиме [6].  В соответствии с требованиями МЭБ для воспроизводства и поддержания клеток линии BF-2 рекомендуется применять различные синтетические культуральные среды, такие как МЕМ, DMEM и другие [6].

Важнейшим показателем при культивировании клеточных линий рыб является температурный режим. Диапазон толерантных температур для клеточной линии BF-2 составляет 15-33ºС [6].

Объект

Клеточная линия из хвостового стебля синежаберного солнечника BF-2 (a bluegill fry caudal trunk).

Предмет

Оптимальная культуральная ростовая среда и температурный режим для повышения пролиферативной активности клеточной линии BF-2 с сохранением высокой чувствительности к вирусам рыб.

Цель

Целью данной работы являлось определение оптимального температурного режима и состава культуральной среды для формирования монослоя культуры клеток BF-2, при которых достигается наибольшая пролиферативная активность клеток и сохраняется их высокая чувствительность к вирусам рыб.

Материалы и методы

В работе применяли постоянную культуру клеток из хвостового стебля синежаберного солнечника BF-2. Посевная концентрация клеток составляла 300 тыс. кл/см3. Для работы использовали культуральные среды МЕМ BSS Хэнкса, DМЕМ/ F12 (Sigma), Лейбовица L-15, RPMI-1640 с добавлением 4 мМ L-глутамина и солей Эрла. Для поддержания рН 7,2 – 7,8 применяли 1М Нереs-буферный раствор (рН 7,0) до конечной концентрации 0,02 М. С целью угнетения жизнедеятельности грибов, бактерий и микоплазм в ростовую среду вносили смесь антибиотиков, содержащую на 1 мл: 100 МЕ пенициллина, 100 мкг стрептомицина, 50 мкг гентамицина и 100 МЕ микостатина.

Монослой клеток BF-2 выращивали в СО2-инкубаторах с разными температурными режимами – 10, 15, 20, 25, 30ºС. Формирование монослоя и жизнеспособность клеток оценивали на 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 14 сутки после посева. Дезагрегацию монослоя при субкультивировании осуществляли смесью трипсина 0,25% и версена 0,02% (3:1). В качестве критериев оптимальной температуры культивирования служили индекс пролиферативной активности и длительность их сохранения при заданных температурных режимах. Определение концентрации клеток проводили по стандартной схеме с помощью автоматического счетчика клеток «Countess».

Выделение вирусов ИНГТ, ИНПж, ВГС проводили в культуре клеток BF-2, полученной при подобранных оптимальных условиях, в соответствии с требованиями МЭБ [6].

Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием стандартных методов обработки выборок варьирующих переменных. Вычислительные операции и графические построения выполняли с помощью приложения Microsoft Office Excel.

Результаты

 На первом этапе работы оценивали влияние состава культуральных сред на динамику формирования монослоя клеток  BF-2. Для этого применяли среды МЕМ BSS Хэнкса, DМЕМ/F12, Лейбовица L-15, RPMI-1640 и проводили культивирование в течение 14 суток.   Микроскопирование монослоя и определение концентрации клеток осуществляли с интервалом раз в 2 дня (табл. 1; рис. 1).

Рис.1

Рисунок 1. Влияние состава культуральной среды на индекс пролиферации культуры клеток BF-2

Прирост клеток наблюдали во всех испытанных средах, но его величина была разной. Конфлюэнтный монослой формировался на                   1-2 сутки инкубирования при использовании всех предложенных сред. Максимальный индекс пролиферации (3,69±0,05) c формированием плотного монослоя и характерной морфологией клеток BF-2 отмечали при использовании среды DМЕМ/F12.

Таблица 1.

Влияние состава культуральной ростовой среды на пролиферативную активность клеточной линии BF-2 (n=3)
Таблица1

Аналогичный результат был получен в среде МЕМ BSS Хэнкса, однако на 11 сутки инкубирования появлялись флотирующие клетки. При этом индекс пролиферации снижался до 3,56±0,05. Более низкие показатели прироста клеток BF-2 отмечали в средах Лейбовица L-15 и RPMI-1640. На 10 сутки инкубирования в этих средах клетки монослоя приобретали нехарактерную округлую форму, однако прирост клеток продолжался в течение всего периода культивирования (14 суток).

Из таблицы 1 следует, что оптимальной средой для культивирования клеток линии BF-2 является среда DМЕМ/F12, поскольку при ее использовании достигается высокая скорость формирования конфлюэнтного монослоя и наибольший прирост клеток (3,69±0,05).

На следующем этапе работы определяли влияние температуры на динамику роста и формирования монослоя BF-2. Для этого клетки культивировали при 10, 15, 20, 25, 30ºС в ростовой среде DМЕМ/F12. При 20, 25, 30ºС конфлюэнтный монослой формировался в течение 24 часов после посева, а при 10, 15ºС образование монослоя наблюдалось спустя 2-3 суток (табл. 2).

Таблица 2.

Влияние температурного режима на пролиферативную активность клеток линии BF-2 (n=3)

Таблица2

Как следует из таблицы 2, наиболее высокий индекс пролиферации клеток BF-2 достигался при 30ºС, но спустя 7-8 суток    возникало разрежение монослоя. Инкубация клеток при 10 и 15ºС позволяла сохранять монослой без пересева и смены среды в течение 20-25 и 18-20 суток, соответственно, однако при этом индекс пролиферации был ниже.

Таким образом, при увеличении температуры культивирования   (10-30°С) наблюдался рост индекса пролиферативной активности клеток линии BF-2 с 3,02 до 4,03 и снижение продолжительности их переживания без смены среды с 25 до 7 суток.

На дальнейшем этапе работы исследовали чувствительность к вирусам рыб монослоев культуры клеток BF-2, выращенных с использованием культуральной среды   DМЕМ/F12 при 10, 15, 20, 25, 30°C. Для анализа использовали патологический материал от радужной форели, семги, лосося, инфицированный вирусами ИНГТ, ИНПж, ВГС с титрами накопления 2,0-5,0 lg ТЦД50/см3, соответственно. Специфичность инфекционного агента была подтверждена результатами сэндвич-варианта ИФА,

РИФ и ОТ-ПЦР. Пробы патматериала были отобраны в рыбоводческих предприятиях Северо-Западного ФО РФ в 2004-2009 гг. (табл. 3).

Таблица 3.

Исследование чувствительности выращенной при разных температурах BF-2 к вирусам ИНГТ, ИНПЖ, ВГС (n=3)Таблица3

Из таблицы 3 следует, что клеточная линия BF-2, выращенная с применением культуральной среды DMEM/F12 при 15°С, имеет более высокие показатели чувствительности к вирусам ИНГТ, ИНПж, ВГС по сравнению с клетками, выращенными с использованием той же среды, но при иных температурных режимах.

Таким образом, культивирование BF-2 при 15°С с использованием ростовой среды  DMEM/F12 является оптимальным, поскольку позволяет повышать индекс пролиферативной активности клеток и сохранять высокую чувствительность данной клеточной линии к вирусам ИНГТ, ИНПж и ВГС.

Заключение

Определены оптимальный состав ростовой среды и температура для культивирования перевиваемой клеточной линии BF-2. Высокий индекс пролиферации клеток был достигнут при 15ºС и использовании среды DМЕМ/F12 (Sigma) с добавлением 4 мМ L-глутамина, солей Эрла, 0,02М Нереs-буферного раствора, 10% фетальной сыворотки телят и смеси антибиотиков. Подобранные условия позволили сократить время формирования конфлюэнтного монослоя BF-2 до 1 суток, повысить пролиферативную активность клеток до 3,17±0,01 и увеличить срок хранения монослоя без деструктивных изменений до 18-20 суток. Чувствительность выращенных в данных условиях клеток линии BF-2 сохранилась на высоком уровне.

Список использованных источников

  1. Дьяконов Л.П. живая клетка в культуре (методы и применение в биотехнологии). М.: Спутник+, 2-е изд., доп. 2009. 656 с.
  2. Грищенко Л.И., Акбаев М.Ш. Болезни рыб и основы рыбоводства: Учебник для студентов вузов. М., 2013. 456 с.
  3. щелкунов И.С. Эпизоотическая ситуация по вирусным болезням культивируемых рыб // Ветеринария. № 4. 2006. С. 22-25.
  4. Lorenzen, E. Inter-laboratory comparison of cell lines for susceptibility to three viruses: VHSV, IHNV and IPNV / E. Lorenzen, B. Carstensen, N.J. Olesen // Dis. Aquat Organ. Vol. 37, № 2. 1999. P. 8188.
  5. General Cell Collection BF-2// ECACC: Европейская коллекция клеточных культур. URL: http:// sputnic-group.ru/catalog/section_1380015/ (дата обращения 17.02.2016).
  6. 2006. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals. Paris: Word Organization for Animal Heatch, 2009, 5th ed. 467 p.

Post a comment

Book your tickets